Д.м.н., профессор, руководитель Лаборатории герпесвирусов Львов Н.Д.
К.м.н., ведущий научный сотрудник Панюкова Е.М.
ФГБУ НИИ вирусологии при ФНИЦЭМ им. Гамалеи Министерства здравоохранения России
Одним из важнейших достижений в изучении этиологии рака принято считать установление факта причинно-следственной связи между папилломавирусной инфекцией (ПВИ) и раком шейки матки (РШМ) [7]. В настоящее время в мире ежегодно регистрируется до 500 000 новых случаев РШМ. При раке в 90-100% случаев в опухолевом материале из шейки матки обнаруживается ДНК папилломавирусов человека (ВПЧ), в то время как инфицированность в популяции здоровых женщин не превышает 5-20% [7]. Исследования показали, что 95% неоплазий шейки матки содержат разновидности ВПЧ, принадлежащие к типам «высокого риска» (ВПЧ 16, ВПЧ 18, ВПЧ 31, ВПЧ 33 и ВПЧ 45) [11]. Диагностика папилломавирусной инфекции обладает высокой клинической значимостью, так как позволяет очертить группу онкологического риска, т.е. выявить среди здоровых женщин тех, кому в первую очередь необходимо проведение активных, комплексных мер, направленных на профилактику и раннюю диагностику РШМ. В настоящее время тестирование на ПВИ широко применяется в скрининговых программах по профилактике и ранней диагностике РШМ. Согласно проспективным исследованиям, признаки ранних предраковых изменений развиваются не менее чем у 15-50% женщин, продемонстрировавших положительный ВПЧ-тест на фоне нормального цервикального эпителия, причём время морфологической трансформации измеряется всего несколькими годами или даже месяцами [9,10,15]. Диагностика ПВИ стала достоверной лишь с появлением методик, основанных на детекции нуклеиновых кислот – гибридизации ДНК и полимеразной цепной реакции.
В зависимости от целей и возможностей лабораторий, широко применяются различные техники гибридизации, такие как Саузерн-блот, дот-блот, in situ, filter in situ и т.д. [16, 17]. Все они основаны на использовании ВПЧ-ДНК в качестве молекулярного зонда, предварительно меченного радиоактивной или биохимической меткой.
Бесспорными преимуществами в детекции ВПЧ обладает метод Саузерн-блот гибридизации. По сравнению с другими, этот метод характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью и информативностью [17]. При осуществлении Саузерн-блота клеточная ДНК обрабатывается специфическими эндонуклеазами рестрикции, и полученные фрагменты с помощью электрофореза разделяются в агарозном геле. После денатурации ДНК переносится на мембрану, которая в дальнейшем гибридизуется с меченым ВПЧ-зондом. При оптимальном подборе специфических зондов и условий гибридизации можно получить сведения о физическом статусе ВПЧ-ДНК в клетке, типах ВПЧ, филогенетической взаимосвязи папилломавирусов и т.д. [17-20]. Недостатками данного метода являются трудоемкость и длительность выполнения процедуры, а также необходимость использования относительно больших количеств биологического материала для анализа. Эти факторы затрудняют использование Саузерн-блот гибридизации для рутинной диагностики и решения задач скрининга.
Методики, основанные на реакции гибридизации, менее чувствительны к контаминации, чем ПЦР-диагностика, поэтому они являются методом выбора в тех условиях, когда правильная организация ПЦР-лаборатории невозможна, или когда положительные результаты ПЦР-теста вызывают сомнения.
В течение последнего десятилетия лидирующее место в клинической диагностике ПВИ заняли методы, основанные на проведении реакции ПЦР, что связано с её высокой разрешающей способностью, технической простотой и быстротой данной процедуры [21, 22].
Первоначально для ПЦР использовались типоспецифические (TS) праймеры, которые амплифицировали ДНК-последовательности строго определенного типа HPV. Более поздние разработки объединяли несколько пар праймеров в одной реакции амплификации [23]. Многочисленные результаты подтвердили высокую чувствительность данных тест-систем, особенно для «онкогенных» типов ВПЧ [24]. Однако TS-ПЦР охватывает относительно узкий спектр разновидностей ВПЧ, поэтому её применение имеет определённые ограничения.
Для скрининговых и эпидемиологических исследований более эффективны ПЦР-методы, в которых используются консенсусные (или «общие») пары праймеров [25]. С помощью таких праймеров можно выявлять широкий спектр ВПЧ-генотипов, включая новые, неидентифицированные типы.
Несмотря на высокую потенциальную опасность, носительство ВПЧ свидетельствует не о злокачественном процессе как таковом, а о многократно повышенном риске возникновения последнего. Факторы, модифицирующие патогенность ПВИ и, как следствие, провоцирующие опухолевый рост у инфицированных женщин, остаются неизвестными [8, 13].
В публикациях и докладах 1993-2011 гг. (Львов Н.Д.) обосновывается целесообразность комплексного обследования пациентов с целью выявления вирусо-вирусных и вирусо-бактериальных ассоциаций [2,3].
С целью выявления частоты встречаемости вирусо-вирусных, вирусо-бактериальных, и вирусо – протозойных ассоциаций у женщин репродуктивного возраста мы провели комплексное обследование 273 пациенток в возрасте от 22 до 34 лет, включающее: выявление ВПЧ высокого и низкого канцерогенного риска в соскобах из урогенитального тракта при помощи методов полимеразной цепной реакции (ПЦР) и гибридного захвата (ВПЧ Digene-test), изоляцию ЦМВ в культуре клеток из мочи, слюны, крови, цервикального и вагинального отделяемого, определение маркеров ВПГ1/2 методом ИФА, ВПГ – 4 методом ИФА, диагностика хламидий, микоплазм, уреаплазм, трихомонад методом ПЦР, микроскопическое и бактериологическое исследование микрофлоры цервикального канала, влагалища и уретры [5], цитологическое исследование и атомно-силовая микроскопия соскобов с шейки матки и цервикального канала [1].
Инфекции, передаваемые половым путем диагностированы у 64% обследованных женщин. У 20% выявлены трихомонады, у 7% – микоплазмы, у 20% – уреаплазмы, у 4% – хламидии, у 33% –ВПЧ и у 30% – ВПГ. Причем, у 24% из них обнаружена протозойно – бактериально – вирусная ассоциация (трихомонадная – мико-, уреаплазменная – герпетическая – папилломавирусная инфекции), у 7% – вирусная ассоциация (реактивированная герпетическая – папилломавирусная инфекция) и у 16%) выявлено наличиие только скрытых урогенитальных инфекций или их ассоциаций у 13% хламидийная инфекция, и у 3% – хламидийно-уреаплазменная ЦМВ был выявлен методом изоляции в культуре клеток у 47% обследованных женщин. Выделение цитомегаловируса проводилась одновременно из материала проб 5 биологических жидкостей: у 12% он был выявлен в моче, у 4% – в слюне, у 6% в крови, у 13% – в цервикальной слизи и у 12% – в выделениях из влагалища.
Папилломавирусная инфекция была выявлена методом ПЦР у 33% обследованных женщин. Из них ВПЧ высокого онкогенного риска в цервикальном канале выделен у 27% пациенток: 16 тип – 10% женщин,18 тип – у 7% женщин, 31 тип – у 4% и 52 тип – у 6%. ВПЧ низкого онкогенного риска выделен у 6% пациенток: 6 тип – у 3% женщин. 11тип – у 2% женщин, 44 тип – у 1%. Большинство исследователей отмечают значительное разнообразие типов папилломавирусов, выявляемых в каждой отдельно взятой популяции [14]. По данным литературы среди здоровых женщин, так же как и у больных РШМ, наиболее часто обнаруживается ВПЧ-16. В 1,5 – 2 раза реже выявляется ВПЧ-18. Суммарно, на долю ВПЧ-16 и -18 приходится 45% от общего числа всех генитальных папилломавирусов [8]. Распределение ВПЧ по типам подвержено определённым этнико-географическим колебаниям. Например, для стран Азии характерна относительно высокая встречаемость ВПЧ-52 и -58 [12], в то время как на Филиппинах и в странах Латинской Америки несколько увеличена представленность ВПЧ- 45 [13].
По результатам нашего исследования у женщин с неоплазиями шейки матки 16 тип ВПЧ выявляется в 33,3 %, 18 тип – в 28,6%, 31 тип в 19%, 52 тип в 14,3%, 56 тип в 4,8%. Показатели ВПЧ Digene-testa у обследованных женщин колебались от 2 до 2080 относительных единиц (Рис. 1).
Рис.1. Показатели ВПЧ Digene-testa у обследованных женщин.
По нашим данным наиболее часто ПВИ выявляется в возрастной группе от 25 до 29 лет (в группе до 20 лет – у 3,7%, 20-24 года – 33,3%, 25-29 лет – 37%, 30-34 года -22,2%, 35-39 лет 3,7%).
По данным Американской ассоциации здравоохранения – от 14 до 19 лет (рис. 2).
Рис. 2. Распространенность ПВИ в разных возрастных группах по данным Американской ассоциации здравоохранения
По данным анамнеза у обследованных женщин с ПВИ в 11,1% встречались воспалительные заболевания, у 3,7% эндометриоз, бесплодие у 7,4% женщин, миома у 11,1% пациенток, у 7,4% женщин группы выявлена дисфункции яичников. Полученные нами ранее данные [4], показали, что у женщин с ПВИ, чаще, чем в контрольной группе встречается миома матки (рис. 3)
Рис. 3 Частота и структура гинекологической заболеваемости у женщин с папилломавирусной инфекцией.
В нашем исследовании у женщин с ПВИ был выявлен ВПЧ как моноинфекция только у 45% женщин. У 7% – определялась вирусная ассоциация (реактивированная герпетическая – папиломавирусная инфекция), а у 14% – протозойно- бактериально – вирусная ассоциация (трихомонадная – микоплазменная-герпетическая – папиломавирусная инфекции). При этом, у 3% пациенток – была выявлена вирусная ассоциация (реактивированная герпетическая – папиломавирусная инфекция), а у 6% – протозойно- бактериально – вирусная ассоциация (трихомонадная – микоплазменная – уреаплазменная – герпетическая – папиломавирусная инфекции).
У пациенток с фоновыми заболеваниями и легкой дисплазией шейки матки в 50% случаев выявлялись антитела к вирусу герпеса 4 типа, у пациенток с тяжелой дисплазией – в 66% и плоскоклеточным раком шейки матки в 83% случаев.
При изучении показателей интерферонового статуса – у 76% пациенток была снижена продукция интерферона- α (при норме от 128 до 640) до 40, у 54% также снижена продукция интерферона – γ (при норме от 32 до 256) до 16. Причем у женщин с моноинфекцией (ПВИ) наиболее часто (75%) отмечается снижение продукции α – интерферона, а у пациенток с сочетанной вирусно-бактериальной инфекцией – снижение продукции α- и γ- интерферона (72,7%). [6].
Некоторые исследователи выявили уменьшение количества клеток Лангерганса при ПВИ гениталий, кондиломах [26, 27]. Вероятно, что уменьшение плотности клеток Лангерганса в эпидермисе ВПЧ-инфицированных тканей просто представляет собой выход антигенпрезентирующих клеток Лангерганса из эпителия в лимфатические узлы для презентации антигена нативными Т-лимфоцитами [28]. Цитокины являются важным медиатором миграции клеток Лангерганса из ВПЧ-инфицированных тканей в лимфатические узлы. Особенно важна роль цитокинов IL-1α и TNF (в основном секретируемых кератиноцитами) и IL-1β (в основном секретируемого клетками Лангерганса), которые промотируют миграцию клеток Лангерганса, и IL-10, секретируемого кератиноцитами [29]. Возможная ассоциация между дефицитом цитокинов и персистенцией ВПЧ была постулирована [30] на основании факта снижения уровня цитокинов (IL-1α и -1b, TNF, гранулоцит-макрофаг колониестимулирующего фактора) в некоторых ВПЧ-инфицированных цервикальных клеточных линиях и цервикальных опухолевых линиях. Также было показано, что экспрессия TNF кератиноцитами отсутствует в SIL (плоскоклеточные интраэпителиальные повреждения)-биопсированных тканях, но присутствует во всех биоптатах нормального цервикального плоскоклеточного эпителия [31]. И наоборот, экспрессия IL-10 кератиноцитами представлена во всех SIL-биопсированных тканях, но отсутствует в нормальном эпителии. Таким образом, повреждения в системе регуляции экспрессии указанных цитокинов могут отразиться на представлении антигенов в инфицированных тканях клеткам Лангерганса, что может привести к увеличению риска ПВИ или ассоциированных заболеваний.
Таким образом комплексное обследование пациентов и выявление вирусо-вирусных и вирусо-бактериальных ассоциаций целесообразно с целью выявления факторов, возможно модифицирующих патогенность ВПЧ и, как следствие, провоцирующих канцерогенез у инфицированных женщин.
Литература:
Вакцинотерапия вируса простого герпеса: от прошлого до настоящего Ы где мы? Обзор литературы А.м.н. Е.В.Мелехина, Е.Ю.Солдатова, к.м.н. А.А.Музыка, А.м.н. Ж.Б.Понежева ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва РЕЗЮМЕ Рецидивирующее течение инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типов, являетСJI актуальной медико-социальной проблемой. К настоящему времени в арсенале врачей существует не такмного препаратов прямого противовирусного действия, имеющих […]
Вагинальные суппозитории «Ацилакт» от АО «Фирма «Витафарма» — проверенное временем и экономически выгодное средство для поддержания здоровья современной женщины!»