Новые подходы к диагностике герпесвирусной инфекции у женщин с заболеваниями шейки матки

Д.м.н., профессор, руководитель Лаборатории герпесвирусов Львов Н.Д.

К.м.н., ведущий научный сотрудник Панюкова Е.М.

ФГБУ НИИ вирусологии при ФНИЦЭМ им. Гамалеи Министерства здравоохранения России

Одним из важнейших достижений в изучении этиологии рака принято считать установление  факта причинно-следственной связи между папилломавирусной инфекцией (ПВИ) и раком шейки матки (РШМ) [7]. В настоящее время в мире ежегодно регистрируется до 500 000 новых случаев РШМ. При раке в 90-100% случаев в опухолевом материале из шейки матки обнаруживается ДНК папилломавирусов человека (ВПЧ), в то время как инфицированность в популяции здоровых женщин не превышает 5-20% [7]. Исследования показали, что 95% неоплазий шейки матки содержат разновидности ВПЧ, принадлежащие к типам «высокого риска» (ВПЧ 16, ВПЧ 18, ВПЧ 31, ВПЧ 33 и ВПЧ 45) [11]. Диагностика папилломавирусной инфекции обладает высокой клинической значимостью, так как позволяет очертить группу онкологического риска, т.е. выявить среди здоровых женщин тех, кому в первую очередь необходимо проведение активных, комплексных мер, направленных на профилактику и раннюю диагностику РШМ. В настоящее время тестирование на ПВИ широко применяется в скрининговых программах по профилактике и ранней диагностике РШМ. Согласно проспективным исследованиям, признаки ранних предраковых изменений развиваются не менее чем у 15-50% женщин, продемонстрировавших положительный ВПЧ-тест на фоне нормального цервикального эпителия, причём время морфологической трансформации измеряется всего несколькими годами или даже месяцами [9,10,15]. Диагностика ПВИ стала достоверной лишь с появлением методик, основанных на детекции нуклеиновых кислот — гибридизации ДНК и полимеразной цепной реакции.  

В зависимости от целей и возможностей лабораторий, широко применяются различные техники гибридизации, такие как Саузерн-блот, дот-блот, in situ, filter in situ и т.д. [16, 17]. Все они основаны на использовании ВПЧ-ДНК в качестве молекулярного зонда, предварительно меченного радиоактивной или биохимической меткой. 

Бесспорными преимуществами в детекции ВПЧ обладает метод Саузерн-блот гибридизации. По сравнению с другими, этот метод характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью и информативностью [17]. При осуществлении Саузерн-блота клеточная ДНК обрабатывается специфическими эндонуклеазами рестрикции, и полученные фрагменты с помощью электрофореза разделяются в агарозном геле. После денатурации ДНК переносится на мембрану, которая в дальнейшем гибридизуется с меченым ВПЧ-зондом. При оптимальном подборе специфических зондов и условий гибридизации можно получить сведения о физическом статусе ВПЧ-ДНК в клетке, типах ВПЧ, филогенетической взаимосвязи папилломавирусов и т.д. [17-20]. Недостатками данного метода являются трудоемкость и длительность выполнения процедуры, а также необходимость использования относительно больших количеств биологического материала для анализа. Эти факторы затрудняют использование Саузерн-блот гибридизации для рутинной диагностики и решения задач скрининга. 

Методики, основанные на реакции гибридизации, менее чувствительны к контаминации, чем ПЦР-диагностика, поэтому они являются методом выбора в тех условиях, когда правильная организация ПЦР-лаборатории невозможна, или когда положительные результаты ПЦР-теста вызывают сомнения. 

В течение последнего десятилетия лидирующее место в клинической диагностике ПВИ заняли методы, основанные на проведении реакции ПЦР, что связано с её высокой разрешающей способностью, технической простотой и быстротой данной процедуры [21, 22]. 

Первоначально для ПЦР использовались типоспецифические (TS) праймеры, которые амплифицировали ДНК-последовательности строго определенного типа HPV. Более поздние разработки объединяли несколько пар праймеров в одной реакции амплификации [23]. Многочисленные результаты подтвердили высокую чувствительность данных тест-систем, особенно для «онкогенных» типов ВПЧ [24]. Однако TS-ПЦР охватывает относительно узкий спектр разновидностей ВПЧ, поэтому её применение имеет определённые ограничения. 

Для скрининговых и эпидемиологических исследований более эффективны ПЦР-методы, в которых используются консенсусные (или «общие») пары праймеров [25]. С помощью таких праймеров можно выявлять широкий спектр ВПЧ-генотипов, включая новые, неидентифицированные типы. 

Несмотря на высокую потенциальную опасность, носительство ВПЧ свидетельствует не о злокачественном процессе как таковом, а о многократно повышенном риске возникновения последнего. Факторы, модифицирующие патогенность ПВИ и, как следствие, провоцирующие опухолевый рост у инфицированных женщин, остаются неизвестными [8, 13]. 

В публикациях и докладах 1993-2011 гг. (Львов Н.Д.) обосновывается целесообразность комплексного обследования пациентов с целью выявления вирусо-вирусных и вирусо-бактериальных ассоциаций [2,3]. 

С целью выявления частоты встречаемости вирусо-вирусных, вирусо-бактериальных, и вирусо — протозойных ассоциаций у женщин репродуктивного возраста мы провели  комплексное обследование 273 пациенток  в возрасте от 22 до 34 лет,  включающее:  выявление ВПЧ высокого  и низкого канцерогенного риска  в соскобах из урогенитального тракта при помощи методов полимеразной цепной реакции (ПЦР) и гибридного захвата (ВПЧ Digene-test),  изоляцию ЦМВ в культуре клеток из мочи, слюны, крови, цервикального и вагинального отделяемого,  определение маркеров ВПГ1/2 методом ИФА, ВПГ — 4 методом ИФА, диагностика хламидий, микоплазм, уреаплазм,  трихомонад методом ПЦР, микроскопическое и бактериологическое исследование микрофлоры цервикального канала, влагалища и уретры [5], цитологическое исследование и атомно-силовая микроскопия соскобов с шейки матки и цервикального канала [1]. 

Инфекции, передаваемые половым путем диагностированы у 64% обследованных женщин. У 20% выявлены трихомонады, у 7% – микоплазмы, у 20% – уреаплазмы, у 4% – хламидии, у 33% –ВПЧ и у 30% – ВПГ. Причем, у 24% из них обнаружена протозойно – бактериально — вирусная ассоциация (трихомонадная — мико-, уреаплазменная — герпетическая — папилломавирусная инфекции), у 7% — вирусная  ассоциация (реактивированная герпетическая —  папилломавирусная инфекция) и у 16%) выявлено наличиие только скрытых  урогенитальных инфекций или их ассоциаций  у 13% хламидийная инфекция, и у 3% – хламидийно-уреаплазменная ЦМВ был выявлен методом изоляции в культуре клеток у 47% обследованных женщин. Выделение цитомегаловируса проводилась одновременно из материала проб 5 биологических жидкостей: у 12% он был выявлен в моче, у 4% – в слюне, у 6% в крови, у 13% – в цервикальной слизи и у 12% – в выделениях из влагалища.  

Папилломавирусная инфекция была выявлена методом ПЦР у 33% обследованных женщин. Из них ВПЧ высокого онкогенного  риска в цервикальном канале выделен у 27% пациенток: 16 тип — 10% женщин,18 тип  — у 7% женщин, 31 тип  — у 4% и 52 тип  — у 6%.  ВПЧ низкого  онкогенного  риска выделен у 6% пациенток: 6 тип —  у 3% женщин. 11тип  — у 2% женщин, 44 тип  — у 1%.  Большинство исследователей отмечают значительное разнообразие типов папилломавирусов, выявляемых в каждой отдельно взятой популяции [14]. По данным литературы среди здоровых женщин, так же как и у больных РШМ, наиболее часто обнаруживается ВПЧ-16. В 1,5 — 2 раза реже выявляется ВПЧ-18. Суммарно, на долю ВПЧ-16 и -18 приходится 45% от общего числа всех генитальных папилломавирусов [8]. Распределение ВПЧ по типам подвержено определённым этнико-географическим колебаниям. Например, для стран Азии характерна относительно высокая встречаемость ВПЧ-52 и -58 [12], в то время как на Филиппинах и в странах Латинской Америки несколько увеличена представленность ВПЧ- 45 [13].  

По результатам нашего исследования у женщин с неоплазиями шейки матки 16 тип ВПЧ выявляется в 33,3 %, 18 тип – в 28,6%, 31 тип в 19%, 52 тип в 14,3%, 56 тип в 4,8%. Показатели ВПЧ Digene-testa у обследованных женщин колебались от 2 до 2080 относительных единиц (Рис. 1).    

Рис.1. Показатели ВПЧ Digene-testa у обследованных женщин.                      

 

По нашим данным наиболее часто ПВИ выявляется  в возрастной группе от 25 до 29 лет (в группе до 20 лет – у 3,7%, 20-24 года – 33,3%, 25-29 лет – 37%, 30-34 года -22,2%, 35-39 лет 3,7%).  

По данным Американской ассоциации здравоохранения – от 14 до 19 лет (рис. 2). 

 

Рис. 2. Распространенность ПВИ в разных возрастных группах по данным Американской ассоциации здравоохранения 

По данным анамнеза у обследованных женщин с ПВИ в 11,1% встречались воспалительные заболевания, у 3,7%  эндометриоз, бесплодие  у 7,4% женщин, миома у 11,1% пациенток, у 7,4% женщин  группы  выявлена дисфункции яичников. Полученные нами ранее данные [4], показали, что у женщин с ПВИ, чаще, чем в контрольной группе встречается миома матки (рис. 3) 

 

 Рис. 3  Частота и структура гинекологической заболеваемости у женщин с                                    папилломавирусной инфекцией. 

В нашем исследовании у женщин с ПВИ был выявлен ВПЧ как моноинфекция только у 45% женщин. У 7% – определялась вирусная  ассоциация (реактивированная герпетическая — папиломавирусная инфекция), а у 14% — протозойно- бактериально — вирусная ассоциация (трихомонадная — микоплазменная-герпетическая — папиломавирусная инфекции). При этом,  у 3% пациенток  – была выявлена вирусная  ассоциация (реактивированная герпетическая — папиломавирусная инфекция), а у 6% — протозойно- бактериально — вирусная ассоциация (трихомонадная – микоплазменная – уреаплазменная  —  герпетическая  — папиломавирусная инфекции).  

У пациенток с фоновыми заболеваниями и легкой дисплазией шейки матки  в 50% случаев выявлялись антитела к вирусу герпеса 4 типа, у пациенток с тяжелой дисплазией — в 66% и плоскоклеточным раком шейки матки в 83% случаев.  

При изучении показателей интерферонового статуса – у 76% пациенток была снижена продукция интерферона- α (при норме от 128 до 640) до 40, у 54% также снижена продукция интерферона – γ (при норме от 32 до 256) до 16. Причем у женщин с моноинфекцией (ПВИ) наиболее часто (75%) отмечается снижение продукции α – интерферона, а у пациенток с сочетанной вирусно-бактериальной инфекцией – снижение продукции α-  и γ- интерферона (72,7%). [6]. 

Некоторые исследователи выявили уменьшение количества клеток Лангерганса при ПВИ гениталий, кондиломах [26, 27]. Вероятно, что уменьшение плотности клеток Лангерганса в эпидермисе ВПЧ-инфицированных тканей просто представляет собой выход антигенпрезентирующих клеток Лангерганса из эпителия в лимфатические узлы для презентации антигена нативными Т-лимфоцитами [28]. Цитокины являются важным медиатором миграции клеток Лангерганса из ВПЧ-инфицированных тканей в лимфатические узлы. Особенно важна роль цитокинов IL-1α и TNF (в основном секретируемых кератиноцитами) и IL-1β (в основном секретируемого клетками Лангерганса), которые промотируют миграцию клеток Лангерганса, и IL-10, секретируемого кератиноцитами [29]. Возможная ассоциация между дефицитом цитокинов и персистенцией ВПЧ была постулирована [30] на основании факта снижения уровня цитокинов (IL-1α и -1b, TNF, гранулоцит-макрофаг колониестимулирующего фактора) в некоторых ВПЧ-инфицированных цервикальных клеточных линиях и цервикальных опухолевых линиях.  Также было показано, что экспрессия TNF кератиноцитами отсутствует в SIL (плоскоклеточные интраэпителиальные повреждения)-биопсированных тканях, но присутствует во всех биоптатах нормального цервикального плоскоклеточного эпителия [31]. И наоборот, экспрессия IL-10 кератиноцитами представлена во всех SIL-биопсированных тканях, но отсутствует в нормальном эпителии. Таким образом, повреждения в системе регуляции экспрессии указанных цитокинов могут отразиться на представлении антигенов в инфицированных тканях клеткам Лангерганса, что может привести к увеличению риска ПВИ или ассоциированных заболеваний.  

Таким образом комплексное обследование пациентов и выявление вирусо-вирусных и вирусо-бактериальных ассоциаций целесообразно с целью выявления факторов, возможно модифицирующих патогенность ВПЧ и, как следствие, провоцирующих канцерогенез у инфицированных женщин. 

   Литература: 

1. Львов Д.К., Львов Н.Д., Маныкин А.А., Панюкова Е.М., Яковлева В.А. Типирование вируса папилломы человека и атомно–силовая микроскопия при папилломавирусной инфекции у женщин РМЖ. – 2011. — № 31. – 1950.  

1. Львов Н.Д. Герпесвирусы человека – системная, интегративная, лимфопролиферативная иммуноонкопатология.//РМЖ. — 2012. — № 22. – 1133. 

1. Львов Н.Д. Разработка лечебных противогерпетических препаратов и   диагностических тест-систем // Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук. 

1. Львов Н. Д., Панюкова Е.М., Никитина А.А. Клинические проявления папилломавирусной инфекции и структура гинекологических заболеваний у женщин с различными типами ВПЧ.//Материалы Х съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации». Москва, 12-13 апреля 2012, стр. 292. 

1. Львов Н. Д., Панюкова Е.М., Никитина А.А. Исследование состава вагинальной жидкости у женщин с папилломавирусной инфекцией.//Материалы Х съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации». Москва, 12-13 апреля 2012, стр. 292. 

1. Львов Н. Д., Панюкова Е.М., Никитина А.А. Показатели интерферонового и цитокинового статуса у женщин с папилломавирусной инфекцией.// Материалы Х съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации». Москва, 12-13 апреля 2012, стр.292-293. 

1. Bosch F.X., Lorincz A., Munoz N. et al. The causal relation between human papillomavirus and cervical cancer // J. Clin. Pathol. — 2002 — Vol. 55. — P. 244-265. 

1. De Sanjose S., Santamaria M., Alonso de Ruiz P. et al. HPV types in women with normal cervical cytology // The epidemiology of cervical and human papillomavirus / Munoz N., Bosch FX., Shah K.V., Meheus A. (eds.) — Lyon, France: IARC, 1992. — P. 75-84. 

1. De Villiers E.M. Human pathogenic papillomavirus types: an update // Curr. Top. Microbiol. Immunol. — 1994. — Vol. 186. — P. 1-12.  

1. Franco E.L., Rohan T.E., Villa L.L. Epidemiologic evidence and human papillomavirus infection as a necessary cause of cervical cancer // J. Nat. Cancer Inst. — 1999. — Vol. 91. — P. 506-511.  

1. Holly E.A. Cervical intraepithelial neoplasia, cervical cancer and HPV// Ann. Rev. Public. Health. — 1996. — Vol. 17. — P. 69-84. 

1. Huang S., Afonina I., Miller B.A., Beckmann A.M. Human papillomavirus types 52 and 58 are prevalent in cervical cancers from chinese women // Int. J. Cancer. — 1997. — Vol. 70. — P. 408-411. 

1. Munoz N., Kato I., Bosch F.X. et al. Riskfactor for HPV DNA detection in middle-aged women // Sex. Transm. Dis. -1996. — P. 504-510.  

1. Richardson H., Franco E., Pintos J. et al. Determinants of low-risk and high-risk cervical human papillomavirus infections in Montreal University students // Sex. Transm. Dis. — 2000. — Vol. 27. — P. 79-86.  

1. Syrjanen K., Syrjanen S. Epidemiology of human papillomavirus infection and genital neoplasia // Scand. J. Infect. Dis. Suppl. — 1990. — Vol. 69. — P. 7-17.  

1. De Villiers E.M. Hybridization method other then PCR: an update // The epidemiology of cervical and human papillomavirus /Munoz N., Bosch FX., Shah K.V., Meheus A. (eds.) — Lyon, France: IARC, 1992. — P. 111-119. 

1. Wick M.J. Diagnosis of human papillomavirus gynecologic infections // Clin. Lab. Med. — 2000. — Vol. 20. — P. 271-287.  

1. Bernard H.U., Chan S.Y., Manos M.M. et al. Identification and assessment of known and novel human papillomaviruses by polymerase chain reaction amplification, restriction fragment length polymorphisms, nucleotide sequence, andphylogenetic algorithms // J. Infect. Dis. — 1994. — Vol. 170. — P. 1077-1085. 

1. Kjaer S.K., Jensen O.M. Comparison studies of HPV detection in areas at different risk for cervical cancer // The epidemiology of cervical and human papillomavirus / Munoz N., Bosch F.X., Shah K.V., Meheus A. (eds.) — Lyon, France: IARC, 1992. — P. 243-249. 

1. Lorincz A.T. Detection of human papillomavirus DNA without amplification: prospects for clinical utility // The epidemiology of cervical and human papillomavirus / Munoz N., Bosch F.X., Shah K.V., Meheus A. (eds.) — Lyon, France: IARC, 1992. — P. 135-145. 

1. Bauer H.M., Manos M.M. PCR detection of genital human papillomavirus // Diagnostic Molecular Microbiology / D.H. Persing (Ed.) — Washington DC, 1993. — P. 407-419. 

1. Meijer C.J.L.M., van den Brule A.J.C., Shijders P.J.F. et al. Detection of human papillomavirus in cervical scrapes by the polymerase chain reaction in relation to cytology: possible implications for cervical cancer screening // The epidemiology of cervical and human papillomavirus / Munoz N., Bosch F.X., Shah K.V., Meheus A. (eds.) — Lyon, France: IARC, 1992. — P. 271-281. 

1. Mitrani-Rosenbaum S., Tsvieli R., Lavie O. et al. Simultaneous detection of three common sexually transmitted agents by polymerase chain reaction // Amer. J. Obstet. Gynecol. — 1994. — Vol. 171. — P. 784-790. 

1. Schiffman M.H. Epidemiology of cervical human papillomavirus infection // Curr. Top. Microbiol. Immunol. -1994. — Vol. 186. — P. 55-81. 

1. Manos M.M., Ting Y., Wright D.K. et al. Use of polymerase chain reaction for detection of genital human papillomavirus // Cancer Cells. — 1989. — Vol. 7. — P. 209-214. 

1. Morelli A.E., Belardi G., DiPaola G. et al. Cellular subsets and epithelial ICAM-1 and HLA-DR expression in human papillomavirus infection of the vulva. Acta Derm Venerеol 1994; 74: 45—50. 

1. Morris H.H., Gatter K.C., Sykes G. et al. Langerhans’ cells in human cervical epithelium: effects of wart virus infection and intraepithelial neoplasia. Br J Obstet Gynаecol 1983; 90: 412—420.  

1. Memar O.M., Arany I., Tyring S.K. Skin-associated lymphoid tissue in human immunodeficiency virus-1, human papillomavirus, and herpes simplex virus infections. J Investig Dermatol 1995; 105: 99S—104S.  

1. Wang B., Amerio P., Sauder D.N. Role of cytokines in epidermal Langerhans cell migration. J Leukoc Biol 1999; 66: 33—39.  

1. Woodworth C.D., Simpson S. Comparative lymphokine secretion by cultured normal human cervical keratinocytes, papillomavirus immortalized, and carcinoma cell lines. Am J Pathol 1993; 14: 1544—1555.  

1. Mota F., Rayment N., Chong S. et al. The antigen-presenting environment in normal and human papillomavirus (HPV)-related premalignant cervical epithelium. Clin Exp Immunol 1999; 116: 33—40.