Диагностика HHV-8 –индуцированной инфекции при Саркоме Капоши.

Львов Н.Д., Потапова Л.А., Мельниченко А.В., Мезенцева М.В. 

 Диагностика HHV-8 –индуцированной инфекции при Саркоме Капоши. 

   Вирус герпеса человека 8-го типа  (ВГ-8) HHV-8– или KSHV –герпесвирус, ассоциированный с саркомой Капоши вызывает прежде всего саркому Капоши (СК) – мультифокальное заболевание с преимущественным поражением кожных покровов и вовлечением внутренних органов и лимфатических узлов. Также вызывает  ряд других заболеваний – лимфопролиферативные заболевания  лимфомы, ангиоиммунобластоидную лимфоаденопатию, болезнь Кастлемана и др.[1, 2, 6] Известно 5 основных молекулярных субтипов (А-Е) вируса саркомы Капоши. А и С субтипы преимущественно преобладают в Европе, Средиземноморских странах, Китае, США. Субтип В – в Африке, D –на островах Тихого Океана и Японии, Е – в Южной Америке и США, В России наиболее распространены – субтип А (подгруппа А1 , А’ ) реже выявляется субтип С(подгруппы  C’, C”) [ 4, 7 ]  

     Постановка диагноза – саркома Капоши, подтвержденного гистологическими исследованиями биоптата, обычно, не вызывает затруднений. Однако, в ряде случаев, например на ранних этапах формирования саркомы Капоши, когда гистологическая картина нечеткая, и иных сосудистых опухолях, этиологически не связанных с вирусом герпеса 8 типа, но симулирующих очаги саркомы Капоши, бывает необходимо применение дополнительных диагностических процедур, позволяющих провести дифференциальный диагноз. С этой целью проводят исследования маркеров вируса герпеса 8 типа в крови пациента и в очаге саркомы Капоши. Используются различные методы диагностики: ИФА, ПЦР, Нестед-ПЦР, гибридизация in situ, иммуногистохимия.     

    Применение лишь одного метода ИФА или ПЦР не дает высокоэффективной диагностики заболевания. Неудовлетворительная чувствительность ИФА может быть объяснена, в частности, недостаточной иммуногенностью различных вирусных белков или отсутствием литической активации, когда в тест-системе выявляются белки капсида или вирусной оболочки. В случае применения рекомбинантных белков в наборах ИФА необходимо помнить, что рекомбинантный белок не является точной копией нативного белка вируса и часто является его усеченным вариантом. Применение ПЦР диагностики тоже не всегда эффективно – при латентном течении HHV-8-индуцированной инфекции ,  концентрация вирусной ДНК в крови пациента минимальна и может не детектироваться вследствие недостаточной чувствительности тест-системы.[1, 3] 

  В настоящим исследовании предлагается использовать метод ИФА для определения антител класса IgG к малому капсидному белку вируса герпеса 8 типа в сыворотке крови человека (ЗАО «Вектор-Бест») и метод ПЦР для определения ДНК («ДНК-технология») вируса в мононуклеарах периферической крови (МПК) и в биоптате из очага саркомы Капоши, а также оценивать продукцию ИФН-, ИЛ-1 , рецепторного антагониста к ИЛ-1 (РА –ИЛ-1), ИЛ-6 и ИЛ-8. Это позволяет  повышать диагностическую  эффективность исследования и выявлять активацию литического цикла вируса. Выявление прогностических факторов усиления вирусной инфекции позволит реагировать  на возможные обострения комплексом профилактических мер, своевременно корректируя нарушения в иммунной системе.[3, 5, 8] 

    Обнаружение маркеров ВГ-8 хотя бы одним из описанных методов облегчает постановку дифференциального диагноза в случае сомнительной гистологической картины исследуемой гемангиомы. В частности, использование одного метода ИФА, либо одного метода ПЦР с определением ДНК в МПК позволяет определять антитела к малому капсидному протеину ВГ-8 или ДНК ВГ-8 в 45% случаев. Сочетанное использование этих двух методик выявляет маркеры ВГ-8 в 77% случаев, а определение ДНК ВГ-8 в биоптате из очага саркомы Капоши повышает диагностическую чувствительность до 100%. 

   Анализ взаимосвязи ряда иммунологических показателей с маркерами ВГ-8 обнаружил корреляцию между выявлением антител IgG к МКП ВГ-8 и пониженными значениями ИФН –, а также между выявлением  ДНК ВГ-8 и повышением концентрации  РА –ИЛ-1. 

    Исследование содержания ИФН- у пациентов с саркомой Капоши позволяет оценивать риски возможной литической активации ВГ-8, так как уровень ИФН- в сыворотке крови коррелирует с антителами к малому капсидному протеину ВГ-8, а самое высокое содержание ИФН- у пациентов с саркомой Капоши отмечается при отсутствии антител к ВГ-8 (Рис 1, Рис 2). Это дает возможность проведения своевременного профилактического курса лечения, предотвращая появление новых очагов саркомы Капоши и остановки роста уже имеющихся и улучшая общее состояние пациента. 

   Наибольшие значения ИФН- наблюдаются в сыворотке пациентов , где не было антител IgG  к ВГ-8. Однако, при наличии антител по мере роста оптической плотности наблюдается увеличение значений ИФН- . Несомненно, процесс купировании размножения вируса сопровождается усилением барьера для вирусной инфекции, увеличением выработки ИФН- , что полностью укладывается в полученную нами картину распределения. 

Другой закономерностью, выявленной в результате статистического анализа.  оказалось повышение уровня РА-ИЛ-1 у больных саркомой Капоши с выявленной ДНК ВГ-8, результат представлен на рис. 3 

   Повышенное содержание рецепторного антагониста к ИЛ-1 и снижение уровня самого ИЛ-1 уточняет момент снижения воспалительной активности через некоторое время после активации инфекции. Наши исследования показали, что уровень рецепторного антагониста к ИЛ-1 повышен в случае выявления ДНК в МПК пациентов с саркомой Капоши (рис. 3), содержание ИЛ-1, напротив , снижено. Усиление синтеза РА-ИЛ-1 можно рассматривать , как реакцию на поглощение макрофагами вирусной ДНК, либо как компенсаторную реакцию иммунитета, ограничивающую эскалацию воспалительных процессов, поскольку для группы СК показано повышение уровня провоспалительного ИЛ-в сыворотке крови (р=0,0016) – рис.4. Анализ содержания ИЛ-1 и рецепторного антагониста к ИЛ-1 в сыворотке крови помогает осуществлять мониторинг активности воспалительного процесса с тем, чтобы корректировать терапию.  

   Таблица 1.    Корреляция вирусных и иммунных маркеров у пациентов  

                                                    с саркомой Капоши.  

Обобщенные данные позволяют выделить 4 лабораторных варианта течения саркомы Капоши, которые представлены в таблице 1. Эти варианты позволяют получить представления о состоянии вирусной репродукции и иммунореактивности организма. 

 Вариант 1- отсутствие маркеров ВГ-8 параллельно с высоким уровнем ИФН– и сниженным количеством РА-ИЛ-1 характеризует отсутствие обострения.                             Вариант 2 – наличие антител IgG к ВГ-8 и отсутствие ДНК ВГ-8 в крови, а также снижение уровня ИФН– и повышение уровня РА-ИЛ-1 в сыворотке крови больных СК. Это характерно для начинающегося  процесса литической активации размножения вируса на фоне снижения клеточного иммунного ответа, причем о давности активации можно судить по нарастанию титра антител IgG к ВГ-8.                                                               Вариант 3 – наличие ДНК ВГ-8 в МПК , выявление антител IgG к ВГ-8 и высоких уровней РА-ИЛ-1 в сыворотке крови больных. Вероятно, этот вариант характеризует ограничение воспалительных реакций.                                                                                                    Вариант 4– стадия ремиссии на фоне возросшего противовирусного иммунитета , определяемого по повышенным значениям ИФН-и  умеренным уровням РА-ИЛ-1.  

   Определение содержания ИЛ-6 (Рис.5) показано у пациентов с саркомой Капоши для установления активности воспаления и давности активации вирусной инфекции, вызванной ВГ-8. Для ИЛ-6 физиологическим стимулятором является ИЛ-1, и повышение уровня ИЛ-6 происходит после выработки ИЛ-1. Поэтому уровень ИЛ-6 зависит от степени воспалительной реакции и уровня ИЛ-1. Показано, что при обнаружении ДНК ВГ-8 в МПК детектируются более высокие значения ИЛ-6 в сыворотке крови: это означает , что усиление вирусной репликации до величин, доступных для детекции методом ПЦР, по времени совпадает с повышением уровня ИЛ-6. Таким образом, начало литической активации ВГ-8, сопровождаемой ростом титра антител к малому капсидному протеину ВГ-8, постепенным увеличением уровня ИФН- , высоким содержанием ИЛ-1 и невысоким уровнем ИЛ-6, постепенно сменяется ситуацией, когда на фоне повышенной частоты обнаружения ДНК ВГ-8 отмечаются повышенные уровни ИЛ-6, рецепторного антагониста к ИЛ-1 и падение уровня самого ИЛ-1. 

   В проведенных нами исследованиях наименьшие значения ИЛ-8 в сыворотке крови отмечались в случае обнаружения у пациентов с саркомой Капоши антител к малому капсидному протеину ВГ-8 (рис.6), то есть падение выработки ИЛ-8 по времени совпадал с активацией литического цикла ВГ-8. Содержание ИЛ-8, который является хемоаттрактантом,  в сыворотке крови пациентов с саркомой Капоши является косвенным показателем миграции различных иммунных клеток в очаг воспаления, что отражает потенциальную возможность своевременного купирования активации инфекции, вызванной ВГ-8. Поэтому показано проведение  мониторинга  ИЛ-8 для оценки потенциальной возможности и сроков достижения ремиссии при саркоме Капоши. 

  Таблица 2. Ассоциация маркеров ВГ-8 с уровнем цитокинов у больных СК. 

  Таким образом, для комплексной оценки состояния  инфекции и перспектив нейтрализации ее активности у пациентов с саркомой Капоши в период роста опухоли и отсева новых очагов, а также при ухудшении общего состояния пациента, показано проведение  анализа следующих показателей: уровень ИФН – , ИЛ-1, рецепторного антагониста к ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8. Совокупность этих параметров в комплексе с маркерами ВГ-8 позволяет также оценивать  на каком этапе находится активизация инфекции, опосредованной ВГ-8. 

                                                Список литературы 

1. Львов Н.Д. Герпесвирусы – лимфопролиферативная иммунодефицитная патология человека – Материалы научной конференции – Изучение эволюции вирусов в рамках биобезопасности и социальнозначимых инфекций. Москва 24 февраля 2011   

1. Н.Д.Львов, А.В.Мельниченко Вирусы герпеса человека 6, 7 и 8-го типов – новые патогены семейства Herpesviridae – Вопр.вирус. 1999г. № 3, стр.105-111 

1. А.В.Мельниченко, М.В.Мезенцева, Шаповал И.М., Р.Я. Подчерняева , Н.Д.Львов –Сравнительная оценка показателей  интерферонового, иммунного и цитокинового  статуса при комплексном исследовании  больных с герпесвирусными инфекциями, Вопр.вирусол  2011, №6 стр 33-36 

1. Потапова Л.А. Косякова Н.П., Махнева Н.В., Мезенцева М.В. – Вирус герпеса 8-го типа и его роль в патологии человека, Вопр. Вирусол. 2009, № 6, стр.18-23 

1. Ф.И.Ершов, М.В.Мезенцева, А.Н.Васильев, В.Э.Щербенко  идр. Методические укуазания по определению индивидуальной чувствительности организма к интеферонам, другим цитокинам и индукторам интерферона. Ведомости научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств. 2002 , № 1 (9) 

1. Ablashi D., Chatlynne L., Whitman J. et al –Spectrum of Kaposi s sarcoma – Associated Herpesvirus, or Human Herpesvirus 8, Disease // Clinical Microbiology Reviews – 2002 vol.15-p.439-464 

1. Cassar O., S.Bassot, S. Plancoulaine et al.  Human Herpesvirus 8, Southern Siberia  Emerging Infectious Disease 2010 , vol.16- № 3-p.580-582 

1. Zavala F., Rimaniol A., Boussin F. et al  – HIV predominantly induces IL-1 receptor antagonist over IL-1 synthesis in human primary monocytes// J. Immunology-1995-vol. 155 – p.2784-2793 

На рис. 1 показано распределение значений ИФН – среди пациентов с СК в двух подгруппах по признаку выявления антител IgG  к ВГ-8. 

  Зависимость распределения значений ИФН – , определяемых в сыворотке крови больных с СК, от выявления IgG  к ВГ-8 графически представлена на рисунке 4. Медиана для подгруппы с отсутствием IgG составила 0,0 пг/мл, для подгруппы пациентов с СК с выявленными антителами к ВГ-8 составила 12,38 пг/мл (р=0,01) 

На рис. 2 показано распределение значений ИФН- в зависимости от титра антител IgG к ВГ-8.  

  Для выяснения степени падения иммунитета в момент литической активации мы разбили группу больных с СК (n=22) на подгруппы в зависимости от титра антител IgG к ВГ-8. На основании величины оптической плотности (ОП) мы разделили обследуемых на подгруппу «-», где антитела не выявлялись, на подгруппу «+/-» – оптическая плотность не превышала 0,5  на подгруппу «+» – ОП- 0,5-1,0, подгруппу «+» где ОП была 1,0-2,0; подгруппу «++» – ОП-2,0-3,0;  подгруппу «+++» – ОП более 3,0. На основании анализа данных мы получили статистически достоверное отличие (р=0,02) между группами. В подгруппу «+/-» вошел только 1 человек. В группах «++» и «+++» не оказалось ни одного обследуемого. 

На рис. 3  показано распределение значений РА-ИЛ-1 по признаку выявления ДНК ВГ-8 у пациентов СК. Значение медианы у пациентов с выявленной ДНК     ВГ-8 составило 838 пг/мл, а в подгруппе где не было выявлено ДНК ВГ- 8  –     187,5 пг/мл (р=0,0015). 

На рис. 4 показано распределение количества ИЛ-1 , определяемого методом ИФА у пациентов с СК в зависимости от выявления антител IgG  к малому капсидному белку ВГ-8. 

На рис. 5 показано распределение количества ИЛ-6 , определяемого методом ИФА , у пациентов с СК в зависимости от выявления ДНК ВГ-8 в МПК методом ПЦР 

На рис.6   демонстрируется распределение уровня ИЛ-8 , определяемого методом ИФА у пациентов с СК в зависимости от выявления IgG к ВГ-8.