Разработка технологии получения свечевой формы препарата иммуноглобулинов человека с высокими титрами антител к вирусам простого герпеса 1 и 2 типов для лечения хронических форм герпетической болезни

Лазаренко А.А.1, Алимбарова Л.М. 1, Мордвинцева Э.Ю.2, Баринский И.Ф. 1

Разработка технологии получения свечевой формы препарата иммуноглобулинов человека с высокими  титрами антител к   вирусам простого герпеса 1 и 2 типов для лечения хронических форм  герпетической болезни

1ФГБУ «ФНИЦ ЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» МЗ РФ, 123098, Москва, 2ЗАО «ФИРМА «ВИТАФАРМА»,  125124, Москва 

Герпесвирусная инфекция (ГИ), обусловленная вирусами простого герпеса 1 и 2 типов (ВПГ-1, ВПГ-2) является актуальной проблемой здравоохранения [1].   Терапия ГИ представляет большие трудности, несмотря на обширный арсенал терапевтических средств. Этиотропная терапия,  к которой в настоящее время относят  использование как химиопрепаратов, так и специфических иммуноглобулинов – антител к антигенам возбудителей ГИ (ВПГ-1, ВПГ-2), является одним из эффективных направлений лечения ГИ [1,2,3]. Иммуноглобулинотерапия, как иммунотерапевтический подход  к лечению ГИ, имеет ряд  преимуществ по сравнению с химиотерапией и другими лекарственными средствами, что подтверждается данными ряда отечественных и зарубежных авторов [2,4,5]. Однако в клинической практике при лечении ГИ  использование иммуноглобулинов остается до конца не востребованным, что обусловлено рядом причин, основными из которых являются: ограниченный опыт применения данных препаратов врачами общей практики,  фобия перед иммуноглобулинами, как потенциально опасным средствам, вызывающим при внутривенном введении побочные эффекты, а также широкое использование при лечении ГИ химиопрепаратов — синтетических аналогов пуриновых нуклеозидов   [1, 6, 7]. Следует отметить, что иммуноглобулины  обычно хорошо переносятся, нежелательные реакции регистрируются лишь у 1–15% пациентов [8,9].  

  В связи с постоянно регистрируемым ростом иммунодефицитных состояний, появлениием резистентности микроорганизмов к химиопрепаратам, а также наличием противопоказаний для лечения с использованием АЦВ у беременных в 1-2 триместрах беременности, отношение к препаратам иммуноглобулинов, коренным образом меняется, о чем свидетельствуют работы отечественных и зарубежных исследователей [2,3,7,10,11] по применению иммуноглобулинов для лечения активной ГИ у иммунокомпрометированных пациентов; у беременных женщин с целью снижения риска антенатальной передачи вируса и поражения плода; для лечения активной ГИ у новорожденных и детей раннего возраста; для профилактики манифестации заболевания у инфицированных больных в трансплантологии.   

   В РФ используют препараты нормального иммуноглобулина для внутривенного и внутримышечного введения,  иммуноглобулины с повышенными титрами к специфичес-ким возбудителям для внутривенного введения, а также комплексный  иммуноглобулиновый препарат (КИП), применяющийся для лечения бактериальных и вирусных заболеваний ЖКТ, а в  свечевых  формах — вагинально или ректально при лечении ОРВИ и заболеваний урогенитального тракта [12]. В связи с этим, целью данной работы была разработка технологии получения свечевой формы препарата для лечения ГИ, содержащей иммуноглобулины доноров с высоким уровнем вируснейтрализующих антител к ВПГ 1 и 2 типов,  

Материалы и методы 

Материалы.  В работе использовали: штамм ВПГ 1 «УС» (Herpes simplex virus type 1) и штамм ВПГ 2 «ВН» (Herpes simplex virus type 2) типов, полученные из  Государственной коллекции вирусов ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» МЗ РФ. Вирусы культивировали на монослое клеток VERO. Специфическую инфекционную активность штаммов ВПГ  определяли по наличию ЦПД вируса в клетках VERO  и выражали в lg ТЦД50 в 1 мл.  

Объектами исследования являлись лабораторные животные, характеристика которых представлена в таблице 1. Все манипуляции с зоологическими объектами осуществляли при строгом соблюдении правил, предписанных для работ с экспериментальными животными.  

Таблица 1  

                   Животные, использованные в экспериментах 

п/п	Вид животных	Порода, линия, генотип	Пол	Возраст (дней, месяцев, лет)	Вес (живая масса)	Источник получения
1	2	3	4	5	6	7
1	Белые крысы	Аутбредные	♂	5-7 нед.	100-120 г	Питомник «Столбовая»
2	Морские свинки	Аутбредные	♂	3-4 мес.	250-300 г	Питомник «Столбовая»
3	Кролики	Шиншилла	♂	12-24 нед.	2,5-3,0 кг	Питомник «Апрелевка
4	Белые мыши	Аутбредные	♂	2-3 нед.	10-12 г	Питомник «Столбовая»
5	Белые мыши	Аутбредные	♂	3-4 нед.	18-20 г	Питомник «Столбовая»

 

Дизайн исследования:  1) отбор гаммаглобулинов с высоким титром антител к ВПГ-1 и ВПГ-2 в иммуноферментном тесте, 2) определение уровня вируснейтрализующих антител в отобранных сериях гаммаглобулинов в опытах на культуре ткани и животных, 3) лиофилизация иммуноглобулинов, 4) разработка свечевой формы препарата, содержащей гаммаглобулины доноров с высоким уровнем вируснейтрализующих антител к ВПГ-1 и ВПГ-2, 5) изучение сохранности активности вируснейтрализующих антител к ВПГ-1 и ВПГ-2 в свечевой форме препарата. Опыты повторяли трехкратно. 

В работе использовали 150 экспериментально-производственных образцов  нор-мальных иммуноглобулинов человека, полученных от доноров плазмы, не вакциниро-ванных герпетической вакциной («Микроген» МЗ РФ («Иммунопрепарат», Уфа); станция переливания крови ФМБА (Москва). Экспериментально-производственные образцы иммуноглобулина получены методом многостадийного низкотемпературного этанольного фракционирования белков плазмы по Кону и проверены в соответствии с международными требованиями [11, 13,14], требованиями нормативных документов [15,16], а также требованиями ВОЗ по исследованию плазмы крови человека и препаратов иммуноглобулинов [10,11,13,17]. 

Титры антител к ВПГ (IgG) в плазме крови доноров и в препаратах иммуноглобулина определяли   методом иммуноферментного анализа, используя коммерческие наборы для ИФА (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск). ИФА выполняли в соответствии с прилагаемыми инструкциями. Результаты регистрировали с помощью сканирующего спектрофотометра «Stat Fax 3200» (Awareness Technology, Inc, USA) при ƛ 450 нм.  

   Содержание антител к ВПГ (IgG) вычисляли относительно отраслевого стандартного образца «ОСО IgG анти-ВПГ-1,2» (ОСО 42-28-377-05), содержащего вируснейтрали-зующие антитела к ВПГ -1 и 2. В качестве препаратов сравнения использовали коммер-ческие   иммуноглобулины производства ЧАО «Биофарма», Украина — «Гаммалин®» (Им-муноглобулин против ВПГ- 1) и Иммуноглобулин против ВПГ-2. В качестве отрицательной сыворотки, не содержащей  антител IgG к ВПГ-1, ВПГ-2,  использовали стандартную сыворотку производства Нижегородского предприятия по производству бакпрепаратов «ИмБио» по ФС 42-3641-98 (Нижний Новгород). 

Вируснейтрализующую активность и специфичность антител в образцах ОСО, в экспериментально-производственных образцах, а также референс-препаратах определяли методом реакции нейтрализации (РН): в культуре клеток VERO, а также у животных [15,18]. Во втором варианте индикаторной системой РН являлась модель менингоэнцефалита у мышей, которую воспроизводили интрацеребральным введением смеси 100 ТЦД50/мл вируса (штамм «УС» или «ВН») с разведениями образцов иммуноглобулинов. Животным вводили  по 0,03 мл смеси. Обработку результатов проводили методом Спирмена-Кербера [15]. Разность логарифмов титров вируса в контрольных и опытных образцах соответствует логарифму индекса нейтрализации (ИН).    

Определение биологических характеристик иммуноглобулина (стерильности, пиро-генности и токсичности) выполняли по методикам, описанным в ГФ XI1. Пирогенность препаратов оценивали на кроликах, токсичность – на мышах и морских свинках.  

Отсутствие антител к вирусу гепатита С, ВИЧ 1 и ВИЧ 2, отсутствие поверхностного антигена вируса гепатита В в образцах иммуноглобулинов подтверждали с использованием коммерческих наборов для ИФА: «ИФА- HBsAg/м» (ООО «НПО Диагно-стические системы», Нижний Новгород), «ИФА-анти-HCV» «Бест анти-ВГС» (комплект 2);«Бест анти-ВГС — СПЕКТР», «Бест анти-ВГС-IgM» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск); «ДС-ИФА-ВИЧ-АГ+АТ» (ООО «НПО Диагностические системы», Нижний Новгород). 

   Получение сухой субстанции иммуноглобулина осуществляли на сублимацион-ных установках LZ-45 (Чехословакия). Общая продолжительность лиофилизации составила 36 ч. 

Разработка свечевой формы иммуноглобулина.  Суппозитории готовили по общей схеме [16,17]. Иммуностимулятор — гиалуроновую кислоту вводили в свечу одновременно с препаратом иммуноглобулина. Состав  ингредиентов в свече представлен в таблице 2. 

  Таблица 2      

Состав ингредиентов в свече 

№/№	Наименование ингредиента	На одну свечу	Соответствие нормативным документам
1	Иммуноглобулин человека лиофилизированный	80 мг
2	Гиалуроновая кислота (иммуномодулятор)	0,005 г	ТУ.9358.-005-12466809-98
3	Антибиотик: гентамицин сульфат	не более 2,0 мкг	ВФС-42-3709-99
4	Наполнитель: — кондитерский жир	до 75%	ГОСТ 28414-89
5	Парафины нефтяные твердые	7,5%	ГОСТ 23683-89
6	Эмульгатор Т-2	7,5%	ТУ 10-04-40-24-89

 

Определение биологических характеристик иммуноглобулина в свечевой форме препарата (стерильности, пирогенности, токсичности, безопасности, сохранности вируснейтрализующей активности/режим ускоренного старения) выполняли по методикам, описанным в ГФ XI1. Полученный препарат должен быть специфически активен, т.е. вызывать специфический иммунитет к ВПГ при трехкратном введении белым крысам. Наличие антител в сыворотках животных изучали в РН (в культуре клеток). Разность логарифмов титров вируса в контрольных и опытных образцах соответствует логарифму ИН.   Вируснейтрализующая активность сывороток по показателю ИН должна быть не менее 2,0 lg ТЦД 50/мл для  штамма УС и не менее 1,5 lg ТЦД 50/мл для штамма ВН.  

  По результатам проводимых исследований делали вывод о соответствии разработанной формы препарата иммуноглобулина требованиям ГФ XI1 [18,19]. 

        Статистическую обработку результатов проводили с использованием компьютерных программ «Excel 4.0» и «Statistica-6,0» Windows XP. 

                                                   Результаты 

Отбор иммуноглобулинов доноров крови человека со специфическими антителами  к ВПГ 1 и 2 типов в ИФА. Был проведен скрининг 150 серий коммерческих   нормальных   иммуноглобулинов. Исследование проводили методом ИФА. Из них были отобраны  43 образца,   содержащих антитела   к  ВПГ-1, ВПГ-2 в различных титрах. Фоновое содержание указанных антител в образцах иммуноглобулинов составило  1:1600 — 1:3200 (титр). За минимальный допустимый титр антител к ВПГ принимали  величину 1:3200.  Образцы, в которых титры антител превышали в 4-6 и более раз фоновое значение, считали специфическими. В дальнейшем  из тестируемых   образцов   были   отобраны   9,  имеющие титр антител к ВПГ 1  и 2, определенный методом ИФА от  1: 3200 до 1:25600. (табл. 3). 

    Таблица 3  

Титры антител против ВПГ 1 и 2 в препаратах исследуемых иммуноглобулинов в ИФА 

№ препарата	Разведение иммуноглобулинов
	1:3200	1:6400	1:12800	1:25600	1:51200
№ 1	+	+	+	+	+
№2	+	+	+	+	+
№3	+	+	+	+	+
№4	+	+	+	+	+
№5	+	+	+	+	—
№6	+	+	+	+	—
№7	+	+	+	+	—
№8	+	+	+	+	—
№9	+	+	+	+	+

 

Важным свойством  противогерпетического препарата иммуноглобулинов должно быть наличие в них вируснейтрализующей активности, для определения    которой  прово-дили РН  в культуре клеток (VERO) по отношению к вирусам ВПГ 1 и 2.  РН проводили в культуре клеток с дозой вируса (ВПГ-1 или ВПГ-2),  равной 100 ТЦД50/мл (рабочая доза вируса). В качестве отрицательного контроля использовали сыворотку доноров, не содержащую антител к ВПГ 1 и 2. Критерием оценки являлись 2 параметра: титры антител и индекс нейтрализации (ИН), который должен быть не менее 2,0 lg ТЦД50/мл для штамма «УС'» и не менее 1,5 1g ТЦД lg 50/мл для штамма «ВН». Разность логарифмов титров вируса в контрольных и опытных образцах соответствовала логарифму индекса нейтрализации. С этой целью были  исследованы  9 отобранных ранее серий (№1-9). Полученные результаты приведены в таблице 4. 

Таблица 4  

Результаты определения титра вируснейтрализующих антител к ВПГ 1 и 2 в РН на культуре клеток   

Иммуноглобулин,  серия №	Наименование тест-вируса
	ВПГ 1 (штамм «УС»)		ВПГ 2 ( штамм «ВН»)
	Титры антител	Индекс  Нейтрализации, lg	Титры антител	Индекс  Нейтрализа-ции,  lg
1	1:320	2,5	1:320	2,0
2	1:320	3,0	1:320	2,25
3	1:320	2,5	1:320	2,0
4	1:320	2,0	1:320	1,5
5	1:160	1,75	1:320	1,75
6	1:80	1,75	1:320	2,0
7	1:160	1,75	1:80	1,0
8	1:80	1,5	1:160	1,5
9	1:320	2,5	1:320	2,0
ОСО IgG анти-ВПГ-1,2» (ОСО 42-28-377-05)	1: 320		1: 160
«Гаммалин®» (Иммуноглобулин против ВПГ- 1), ЧАО «Биофарма», Украина —	1:320		отр
Иммуноглобулин против ВПГ-2, ЧАО «Биофарма», Украина	отр		1:160
Контрольная  стан-дартная  сыворотка	Отр		Отр

    Как видно из таблицы 4,  отобранные серии иммуноглобулинов доноров че-ловека обладали вируснейтрализующей активностью к ВПГ 1и 2 в титрах 1:80-1:320 и индексом нейтрализации от 1,0lg до 3,0lg. По данным литературы серопозитивными к ВПГ- 1 являются до  85% взрослого населения, а к ВПГ-2 до 20% [1,6].  По результатам проведенных исследований были отобраны 5 серий препаратов иммуноглобулинов с наилучшими показателями в РН — серии №1-4,  № 9. 

     Известно, что препараты крови человека, получаемые путем фракционирования, не могут быть в полной мере вирусобезопасными, поскольку не представляется возможным получение крови от абсолютно здоровых доноров. Даже карантинизация всех порций плазмы не гарантирует отсутствие инфекционных агентов. Жибурт Е.Б. и соавт. [20] указывают, что вирусная безопасность продуктов крови обеспечивается  отбором доноров, тестированием донаций и пулов плазмы, инактивацией и удалением вирусов в процессе производства. В связи с этим нами был проведен контроль отобранных в РН  5 серий иммуноглобулинов на отсутствие вирусов, передающихся при трансплантации (поверхностного антигена вируса гепатита  В, антител к вирусу гепатита С, вирусу иммунодефицита 1 и 2 типов (ВИЧ 1 и 2), которыый не выявил наличие указанных патогенов  ни в одной из 5 серий иммуноглобулинов, что  свидетельствует об эффективности процессов вирусной инактивации и элиминации в исходном материале и его безопасности [19]. 

Следующим этапом нашей работы явилось изучение  специфической безопасности отобранных серий иммуноглобулинов  в соответствии с ФС [16]. Определение  специфической    безвредности (на отсутствие инфекционного ВПГ)  отобранных  5   серий  препаратов  иммуноглобулинов проводили двумя последовательными пассажами на культуре клеток и двумя последующими последовательными пассажами на животных. Материалом второго пассажа спецбезвредности на культуре клеток были интрацеребрально заражены мыши (массой  8-10 г) в объеме 0,03 мл. Наблюде-ние   за   животными    проводили ежедневно в течение двух недель. Признаков заболевания или гибели не было отмечено у животных как опытных, так и кон-трольных групп, что свидетельствовало о безвредности отобранных   серии   иммуно-глобулинов. Далее жидкие формы полученных серий иммуноглобулинов подвергались лиофилизации при  температуре 60±10°С.  

Одной из аттестуемых характеристик препаратов иммуноглобулинов, содержащих противогерпетические антитела, является сохранение специфической активности препарата при лиофилизации, которая была нами изучена по наличию вирус-нейтрализующих антител в РН на культуре клеток VERO. Подробный анализ всех стадий технологического процесса показал, что процесс лиофилизации, как наиболее критичный, существенно не влиял на уровень вируснейтрализующих антител в препаратах (ИН в сериях №1,2,3,4,9  находились в диапазоне от 1,5 до 2,5 1g, и были идентичны данным, полученным в РН с препаратами до их лиофильной сушки) и позволила отобрать из них наиболее стабильные три серии  — № 2, 3 и 9, которые стали основой для разработки  свечевой формы препарата.  

Получение готового препарата. Технология изготовления свечей проводилсь в соответствии с требованиями ФС. Состав свечи приведен ранее (таблица 2). Одна единица свечевой формы содержала 80 мг лиофилизированного  иммуноглобулина. Определение сохранности уровня вируснейтрализующих антител к ВПГ-1 и ВПГ-2 в свечевой форме препарата проводили в РН в культуре клеток и в опытах на животных. Вируснейтрализующая активность образцов иммуноглобулинов по показателю ИН составила 2,5±0,5 1g для штамма «УС » и 2,0 ±0,5 1g —  для штамма «ВН», что соответствовало требованиям нормативных документов. Анализ стабильности уровня вируснейтрализующих антител в образцах свечевой формы препарата в зависимости от времени хранения проводили методом ускоренного старения согласно методическим рекомендациям «Определение стабильности ОСО и других МИБП ускоренным методом», разработанным ГИСК им. Л. А. Тарасевича (2003), в течение четырех месяцев после их приготовления и хранения при +4° С (список Б, в защищенном от света месте при температуре от 4 до 10°С). Результаты исследования показали, что вирусспецифическая активность образцов свечевой формы препаратов иммуноглобулинов по показателю ИН после хранения статистически не отличалась от таковой сразу после лиофилизации, что доказывает отсутствие влияния условий хранения препарата на его качественные характеристики. Готовые формы иммуноглобулинов (№2,3,9) были тестированы на токсичность. Исследования показали отсутствие токсичности у полученных серий свечевой формы иммуноглобулинов. 

Таким образом, анализ биологических и иммунохимических параметров полученных образцов показал, что процесс приготовления препарата не влиял на его иммунобиологические характеристики и,  что разработанные свечевые формы иммуноглобулинов (на основе 3-х отобранных серий) соответствовали требованиям ФС.  

Обсуждение 

Иммуноглобулины человека – группа иммунобиологических препаратов крови, пред-ставляющих собой выделенную промышленным способом иммунологически активную белковую фракцию плазмы крови здоровых доноров, несущую антительную активность различной специфичности. Препараты иммуноглобулинов в основном содержат иммуноглобулины класса G – антитела против различных возбудителей бактериальных и вирусных инфекций и/или их токсинов, обладают иммунозаместительной и иммуномодулирующей активностью. За рубежом и в РФ разработаны свечевые формы препаратов иммуноглобулинов, которые используются для лечения различных инфекционных заболеваний людей, а также применяются в ветеринарии. Преимущество  энтерального применения иммуноглобулинов очевидно: исключение инъекционного введения препарата, возможность использования больших доз, хорошая переносимость. На Российском фармацевтическом рынке зарегистрировано более 100 наименований препаратов крови человека отечественного и зарубежного производства [1], в том числе и для профилактики и лечения рецидивов ГИ [21,22,23,24,25].   

Нами проведены эксперименты по разработке и получению препаратов иммуноглобулина человека с высокими титрами вируснейтрализующих антител к ВПГ-1 и ВПГ-2 в виде свечевой формы. Основой для получения препаратов явились отобранные нами экспериментально-производственные серии иммуноглобулинов, полученные из плазмы специально отобранных доноров  не вакцинированных противогерпетической вакциной, с исходно более высокими, чем общепопуляционные титры специфических антител к ВПГ. Для получения специфического гипериммунного препарата иммуноглобулина с высокой протективной активностью в отношении ВПГ-1, ВПГ-2 в соответствие с международными требованиями отбирается сырье методом ИФА с помощью тест-систем, выявляющих антитела к поверхностным гликопротеинам вируса простого герпеса [21,22].  По нашим данным, содержание антител к ВПГ-1, ВПГ-2 составило 1:3200 – 51200 и было сопоставимо с аналогичным показателем содержания противогерпетических антител в ОСО 42-28-377-05, представляющего пул плазмы, полученной от 800 доноров ((Ig G ВПГ-1 – 1:25000, Ig G ВПГ-2 – 1:1280), и коммерческих иммуноглобулинах для в/в ЧАО «Биофарма», Украина — «Гаммалин®» (Ig G ВПГ-1 – 1:25000, Ig G ВПГ-2 – 1:640), полученное по результатам титрования иммуноглобулинов в ИФА при использовании тест-ситемы Вектор-бест.  

Исследования показали возможность получения свечевой формы препарата иммуноглобулина со стабильными иммунобиологическими характеристиками, основной из которых является вируснейтрализующая активность. Установлено, что вирусспецифические антитела играют существенную роль в патогенезе ГИ. Защитное действие специфических антител связано как с их непосредственным участием в нейтрализации вирусных частиц, так и с активацией комплемент-опосредованного лизиса. Препарат был охарактеризован по наличию в нем вируснейтрализующих антител к ВПГ-1 и 2 типов.   Вируснейтрализующая активность в разработанных нами свечевых формах иммуноглобулинов по показателю ИН составила 2,5±0,5 1g для штамма «УС » и 2,0 ±0,5 1g —  для штамма «ВН», что соответствовало требованиям нормативных документов и было сопоставимо с аналогичными параметрами полуфабриката иммуноглобулинов  до лиофилазации, так и «ОСО IgG анти-ВПГ-1,2» (ОСО 42-28-377-05)  и коммерческих препаратов иммуноглобулинов производства ЧАО «Биофарма», Украина — «Гаммалин®» (Иммуноглобулин против ВПГ- 1) и Иммуноглобулин против ВПГ-2.  

Полученный полуфабрикат иммуноглобулина лиофилизировали, контролировали по иммунологическим показателям и использовали в дальнейшем в качестве активной субстанции для создания свечевой формы препарата. По содержанию вируснейтрализующих антител к ВПГ-1, ВПГ-2 лиофилизированная форма иммуноглобулина сохраняла активность, характерную для жидкого образца, что полностью соответствовало требованиям ФС. 

Разработанная форма иммуноглобулина в виде свечей не является дженериком коммерческих препаратов, так как у них разные источники получения плазмы доноров и  технологии производства, состав подклассов IgG (общее содержание IgG > 95%), способы и количество стадий инактивации и элиминации вирусов. Лекарственная форма иммуноглобулина в виде суппозиториев вирусологически безопасна, соответствуют требованиям к безопасности и эффективности, не обладает токсичностью, пирогенностью и может быть использована в виде метода терапии ГИ у иммунокомпрометированных пациентов,  у беременных женщин, для лечения активной ВПГИ у новорожденных и детей раннего возраста. для профилактики манифестации заболевания у инфицированных больных в трансплантологии.  

ЛИТЕРАТУРА 

1. Баринский И.Ф., Махмудов Ф.Р. Герпес (монография ). Баку. 2013. 353 стр.
2. Лютов А.Г., Алешкин В.А., Мостовская Е.В., Усольцева В.В. Отечественный иммуноглобулин для внутривенного введения: инновационная технология и перспективы применения. Лечение и профилактика.- 2012.-№3 с 109-112.
3. Intravenousimmunoglobulins in the third millennium / Eds. M.C. Dalakas, P.J. Späth. – Boca Raton, London, New York, Washington: Parthenon Publishing Group, 2004. 
4. Супотницкий М.В., Елапов А.А., Борисевич И.В., Кудашева Э.Ю., Климов В.И., Лебединская Е.В. Иммуноглобулины для внутривенного введения в аспекте показателей качества, эффективности и безопасности.  Успехи современного естествознания . – 2015. –  №5. –P. 182–183. 
5. Алешкин В.А., Лютов А.Г., Афанасьев С.С. Место иммуноглобулиновых препаратов в лечении и реабилитации инфекционных больных. Новые лекарственные препараты. 2003.Т.4.с.6.
   6.leBlanc, PesnicakL, Godleski M, Straus SE. Treatment of HSV-1 infection with immunoglobulin or acyclovir: comparison of their effects on viral spread, latency, and reactivation. Virology. 1999; 230-262(1). 
6. Иванов В., Мосягин В, Вдовиченко М., Кудашева Э., Бондарев В., Борисевич И. Иммуноглобулин человека нормальный: эффективность и безопасность применения. Врач. -2015.- №11. с .17-20.
7. Аверченков В.М, Палагин И.С. Внутривенные иммуноглобулины: механизмы действия и возможности клинического применения. Клиническая микробиологическая и антимикробная химиотерапия. 2004:6(3):273–81. 
8. Кудашева Э.Ю., Иванов В.Б., Борисевич И.В., Бондарев В.П., Миронов А.Н. Качество исходной плазмы – основа эффективности производства препаратов донорской крови.  Медицинская иммунология. 2015. т17., №S, с.401.
9. Conceptpaper on Guideline on the clinical investigation of human normal immunoglobulin for intravenous administration (IVIg) and Core SmPC (EMA/CHMP/BPWP/572805/2013) [официальный сайт] [Электронный ресурс] URL: http обращения 18.05.2015). 
10. Bertolini J., Goss N., Curling J. Production of plasma proteins for therapeutic use. – N.J.: John Wiley & Sons, – 2013. – P. 363–364.
11. Государственный реестр лекарственных средств Министерства здравоохранения Российской Федерации [Электронный ресурс]. URL: http://grls.rosminzdrav.ru/grls.aspx (дата обращения: 12.02.2016).
12. WHO recommendations for the production, control and regulation of human plasma for fractionation, annex 4, WHO Technical Report Series № 941, 2007.
13. International Quality Plasma Program (IQPP) [официальныйсайт] [Электронный ресурс] URL: http://www.pptaglobal.org/safety-quality/standards/iqpp (дата обращения 18.05.2015). 
14. Миронов А.Н., Бунатян Н.Д., Васильев А.Н., Верстакова О.Л., Журавлева М.В.. Лепахин В.К. и др. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (иммунобиологические лекарственные препараты), Ч. 2. М.: Гриф и К; 2012.
15. 16. Общая фармакопейная статья «Иммуноглобулины человека»: утв. приказом Минздрава России от 21.11.2014 № 768. [Электронный ресурс] URL: http://www.rosminzdrav.ru/ministry/61/11/materialy-po-deyatelnosti-deparatamenta/stranitsa-856/utverzhdennye-farmakopeynye-stati-i-obschie-farmakopeynye-stati-po-preparatam-krovi (дата обращения: 12.02.2016).
16. WHO Expert Committee on Biological Standardization: forty-third report. Geneva, 1992; WHO Technical Report Series 840; [Электронныйресурс] URL: http://whqlibdoc.who.int/trs/WHO_TRS_840.pdf (дата обращения: 21.03.2014). 
17. 18. Рекомендации по эпидемиологическому надзору за энтеровирусами для поддержки программы ликвидации полиомиелита. Женева: ВОЗ; 2005. 
18. Корнилова О.Г., Кривых М.А., Кудашева Э.Ю., Бунатян Н.Д., Лебединская Е.В.,Не-чаев А.В., Парамонова Е.В., Миронов А.Н.. Гармонизация требований к специфической безопасности препаратов иммуноглобулинов человека с мировыми стандартами качества.Фармация.2015-№2,стр.43-46.
19. Жибурт Е.Б., Тазаев В.Н. Проблема донорских кадров: изучение и возможные пути решения.Трансфузиология-С-Пет. №4(т.6) 2005.стр. 22-30. 

21 Алешкин В.А., Новикова Л.И., Афанасьев С.С., Борисова И.В., Зуева М.М., Зорик A.B. Способ получения иммуноглобулинового препарата для профилактики и терапии бактериальных и вирусных инфекций, иммуноглобулиновый препарат для профилактики и терапии бактериальных и вирусных инфекций (варианты) и суппозитории на основе иммуноглобулинового препарата /  Патент РФ № 2255766 05.03.2003. МПК А61К 39/395.  

22. Кудашева Э.Ю., Исрафилов А.Г., Загидуллин Н.В., Хабибуллина В.В., Хазиев А.Ф.. Разработка препарата антицитомегаловирусного иммуноглобулина для внутривенного введения.Биопрепараты. Профилактика, Диагностика. Лечение. 2010. №3(39).с.51-52..
23. 2 Алешкин В.А., Афанасьев С.С., Новикова Л.И., Борисова И.В., Волков А.В., Зуева М.М., Кострова О.М. Иммуноглобулиновая основа для иммунобиологических препа-ратов и способов ее получения, суппозитории и мазь для профилактики и терапии бакте-риальных и вирусных заболеваний. Патент на изобретениеRUS 2361612 21.12.2007.
    22.Алешкин В.А., Афанасьев С.С., Давыдкин В.Ю. И др. Патент на изобретение RUS 2240136 10.04.2003. 
24. Мелихова А.В., Давыдкин В.Ю., Алёшкин В.А., Давыдкин И.Ю.Способ получения иммунобиологического препарата. Патент на изобретение RUS 2371199 03.06.2008.